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摘 要 :本文结合笔者的临床医学实践,对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一论述.

关 键 词 :实时定量;PCR;应用

聚合酶链式反应自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具.实时定量PCR技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术,所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量.实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势.首先,它不仅操作简便、快速高效,而且具有很高的敏感性和特异性.其次,由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作.另外,它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,即多重扩增.本文将对实时定量PCR目前的应用状况及实验条件的优化作一论述.

一、实时定量PCR的应用现状

实时定量PCR技术自1996年诞生以来,由于它显著的优越性,不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域,而且也开始作为一种诊断手段应用于临床.其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量,核酸多态性分析,基因突变分析等多个领域.

Giulietti 等人对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述.细胞因子是一种调节蛋白,它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用,其量的改变常常与一些疾病,如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系.由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测,另外,通常用的蛋白质检测方法(如ELISA)的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测,所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义.

众所周知,cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术,但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析,而不能进行定量分析.Rajeevan等人利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化,不仅有效地证明了上述两种方法的有效性,而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术.

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实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法,而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究.例如Laird和他的同事们建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法,它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化.由于实时PCR的敏感性和特异性,使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度.最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞.又如Sevall等人证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因.这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针,该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交,由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的,所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性,若两种信号都增强则表明为异源性.

目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上,这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测,目前已有标准的操作手册供人们使用,但是必须明确,国际上既没有统一的病毒荷载的标准,也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论.这里值得一提的是一种称为NASBA的技术,它是一种利用电化学以光的等温PCR反应,在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子,分子beacon常用于这种技术,这మ

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1;方法常常用于对逆转录病毒的定量测定.


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二、实时定量PCR的实验方案优化

由于各家公司生产的热循环仪提供的各种实验方案不太一致,所以优化的策略也不尽相同,然而在各种方案中,影响实时PCR 反应的因素却总是相通的.只要能较好地控制实验条件,优化实验步骤,要想获得满意的实验结果并不一定都是困难的.下面本文将就影响到实验结果的一些基本参数和实验步骤谈一谈关于实时定量PCR的优化.

1. 基本参数的优化

1.1 MgCl2的浓度.在PCR反应中,MgCl2的浓度对影响酶的活性是至关重要的,不仅如此,合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossing point)值,较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值.所以对其的深度选择应慎重.一般来说,对以DNA或cDNA为模板的PCR反应,应选择2-5mM浓度的MgCl2,对以mRNA为模板的RT-PCR而言,则应选择的浓度为4-8mM.

1.2模板的浓度.如果研究者是进行首次实验,那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验,以选择出最为合适的模板浓度,如果条件困难,也至少要选择两个稀释度(高和中、低浓度)来进行实验.一般而言,使Cp位于15-30个循环比较合适,若大于30则应使用较高的模板浓度,如果Cp小于15则应选择较低的模板深度.对于Cp值的确定,经验上是SYBR Green I探针的荧光信号比本底高2倍,杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍.

2. 使用SYBR Green I测定DNA时的条件优化

2.1MgCl2的浓度.大多数引物-模板对其的要求是2-4mM.

2.2模板的浓度.初次实验要求做一系列的稀释浓度,如条件限制,至少完成两个稀释的度的测定.基因组DNA在50ng-5pg之间选择,质粒DNA在10^6拷贝数左右选择.

2.3 PCR抑制子.通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释,但是在某些条件下,抑制子的浓度高,而模板量少,稀释法就不再能达到好的效果,反会使反应的敏感度降低,所以,研究者若要进行实时定量PCR研究,最好选用纯化的模板.

2.4 引物的浓度.引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素,其浓度太低,会致使反应不完全,若引物太多,则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加.对于大多数PCR反应,0.5uM是个合适的浓度,若初次选用这个浓度不理想,可在0.3-1.0uM之间进行选择,直至达到满意的结果.

2.5退火温度.首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃,然后在1-2℃内进行选择.一般地,退火温度要根据经验来确定,这个经验值往往会同计算得到的Tm值有较大的差距.

3. 用SYBR Green I进行一步法RT-PCR的条件优化

3.1 MgCl2的浓度.不同的靶分子选用不同的浓度,通常是在4-8mM之间选择.

3.2模板的浓度.RT-PCR实验既可以选用总RNA,又可以选用mRNA,其浓度应在1pg-1ug之间选择.对于低模板浓度,可以增加适量的MS2或用alternative RNA 作为载体进行测定.

3.3对照设置.每一引物都应设有阴性对照,阳性对照和污染对照.

4. 杂交探针测定DNA

4.1 MgCl2的浓度.在2-4mM的基础上加0.5-1.0mM,但是不要超过2.0mM.

4.2杂交探针的浓度.初次实验每个探针用0.2uM,如果信号强度达不到要求,可以增加至0.4uM.

4.3对照设置.每一引物都要设阴性对照,每一探针都要设阴性对照.每次实验都要设阳性对照.

4.4 其它的条件同SYBR Green I.

5.用杂交探针实时定量RT-PCR

5.1 MgCl2的浓度.在4-8mM之间进行选择.

5.2杂交探针的浓度.初实验用0.2uM,如果荧光信号强度不足,可以增加至0.4uM.

5.3模板浓度设置.优化的扩增须进行一系列知释度的实验,在条件有困难的条件下,至少要进行两个稀释度的测定.选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA,若是模板的浓度过小(小于10ng/ul),则可加入MS2或alternative RNA作为载体.

5.4 对照设置.每个引物都要设无模板对照,阳性对照以及污染对照.

6.关于杂交探针的评价.在使用杂交探针进行实验时,必须注意防止探针-引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸.引物-探针二聚体的形成,主要是因为探针可与引物的3’末端杂交,其形成以后,会致使此二聚体扩增,从而同目的基因竞争反应的原料,致反应的效率下降.探针其本身能同目的基因相结合,且其解链温度高于引物,所以它可能作为引物而引发延伸反应,为了防止发生这种现象,通常是将其3’末端完全磷酸化,使之不能延伸,若此磷酸化不完全或是没有磷酸化,就会产生目的基因的副产品,从而干扰实验结果.鉴于以上这两点,所以应对探针精心设计,并将其末端完全磷酸化.


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目前的实时定量PCR技术进展迅速,本文是结合本实验室的工作经验以及文献资料写成的,文中提到的不能一概而论.所以不论研究者想进行何种研究,都应根据自己的情况首先找到适合自己研究目的的条件,本文仅供有意于运用实时定量PCR进行研究的人员参考.

参考文献:

[1]Saiki, R.K., S. Scharf, F. Faloona, K.B. Mullis, G.T. Horn, H.A. Erlich and N. Arnheim. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985. 230:1350-1354.

[2]Montogomery, R.A, and Dallman, M.J 1997 Cytokine 9,717-726.

[3]Schmittgen TD. Real-time quantitative PCR.Methods. 2001 Dec,25(4):383-5.

参考文献:

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