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摘 要 实验目的 构建小鼠端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)基因启动子调控EGFP基因表达载体,并研究其在细胞中的转录活性.实验方法 从小鼠肌肉组织中提取全基因组,以它为模板,克隆得到mTERT启动子基因(mTERTp)片段.得到的片段经Sac I/Xba I双酶切后插入到载体pGL3-Enhancer上,得到重组质粒pmTERTp.以pEGFP-N1为模板PCR扩增得到EGFP片段,片段EGFP经Nde I/Xba I双酶切后插入到载体pmTERTp上,得到重组质粒pmTERTp-EGFP.通过脂质体介导重组质粒pmTERTp-EGFP瞬时转染NIH-3T3细胞和B16细胞,观察EGFP蛋白的表达情况.实验结果 重组质粒pmTERTp-EGFP转染B16细胞48h后,可以看到EGFP蛋白大量表达.而在NIH-3T3细胞中EGFP蛋白不表达.结论 mTERT启动子在正常细胞中无明显的转录活性,而在肿瘤细胞中的转录活性很高,说明mTERT启动子能特异性调控目的基因只在肿瘤细胞中表达.

关 键 词 mTERT启动子 基因治疗 靶向转录

【分类号】:R346

端粒酶是一种核糖核蛋白,由端粒酶RNA(TR)、端粒酶相关蛋白(TP)和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)组成.其中TR和TP在正常组织和肿瘤组织中都会持续表达,无组织特异性.而TRET在过表达的情况下, 即使细胞端粒已经缩短同样会导致小鼠形成肿瘤[1,2].这说明决定端粒酶活性的主要因素是端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT).研究表明,它在大多数人和小鼠的肿瘤细胞中表达上调[3,4,5],而在人的正常体细胞中不表达, 在小鼠正常体细胞中表达量很低[6].在这一过程中TERT基因启动子的转录活性扮演重要角色,TERT启动子转录活性具有肿瘤特异性.端粒酶逆转录酶启动子在肿瘤组织有很高活性,而在正常组织中活性很低.这样抗肿瘤基因在肿瘤细胞中靶向性表达就有可能性.端粒酶的功能在于能够以自身携带的RNA为模板,逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端,这样就阻止细胞分裂过程中端粒的进行性降解,从而维持了染色体端粒长度的稳定.因此,它是细胞无限增殖的必要条件之一,与细胞的增殖、衰老、凋亡、永生有关[7].

将抗肿瘤基因置于TERT启动子的调控下,端粒酶阴性的正常细胞中,TERT启动子的活性明显受到抑制,这样就不能表达目的蛋白;端粒酶阳性的肿瘤细胞中,TERT启动子被明显激活,因而就能特异性的表达目的蛋白,这样可以使目的基因选择性的在肿瘤细胞中表达,并且不会影响正常组织,从而准确的杀伤肿瘤细胞[8].

目前,对小鼠的TERT启动子区研究相对较少.鉴于TERT启动子的人源和鼠源序列差异较大,本研究中我们从小鼠基因组中克隆了小鼠TERT启动子(mTERTp)片段,将mTERTp片段和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)构建到真核载体pGL3-Enhancer上,得到重组质粒pmTERTp-EGFP,利用绿色荧光蛋白报告基因检测mTERTp启动子在小鼠成纤维细胞NIH-3T3和小鼠黑色素瘤细胞B16中的转录活性,为下一步利用小鼠动物模型研究肿瘤基因靶向治疗奠定基础.

1实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2实验方法

1.2.1 mTERT启动子基因片段的PCR扩增和鉴定

取正常小鼠的腿部肌肉30 mg,按照Biomiga 公司的基因组提取试剂盒的说明书提取小鼠的全基因组.然后以小鼠基因组为模板,以FW(mTERTp)01/RV(mTERTp)03为上下游引物进行PCR扩增,获得mTERTp基因片段.将得到的目的片段连接到pEASY-T1载体上并转化至大肠杆菌DH5α.经蓝白斑筛选,挑取白色菌落提取质粒,进行PCR和双酶切验证.阳性转化子由华大基因生物技术有限公司进行测序验证.

1.2.2 重组质粒pmTERTp的构建

以质粒pEASY-T1- mTERTp为模板,以FW(mTERTp)01/RV(mTERTp)03为上下游引物进行PCR扩

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增mTERTp基因片段,PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并对PCR片段采用胶回收试剂盒进行回收,然后于37 ℃经Sac I/Xba I双酶切4 h.然后与经过相同酶切的载体pGL3-Enhancer在16 ℃过夜连接.次日将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞,利用菌体PCR筛选阳性转化菌株提取质粒,质粒用Sac I/Xba I进行酶切鉴定,获得的重组质粒pmTERTp由华大基因生物技术有限公司进行测序验证.


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1.2.3重组质粒pmTERTp-EGFP的构建

以质粒pEGFP-N1为模板,以FW(EGFP)/RV(EGFP)为上下游引物进行PCR扩增EGFP基因片段,PCR产物用1%琼脂糖凝胶回收并纯化,然后于37 ℃经Nde I/Xba I双酶切4 h.然后与经过相同酶切的载体pmTERTp在16 ℃过夜连接,连接产物全部转化到E.coli DH5α感受态细胞,利用菌体PCR筛选阳性转化菌株提取质粒,质粒用NdeI/Xba I进行双酶切鉴定,获得的重组质粒pmTERTp-EGFP由华大基因生物技术有限公司进行测序验证.

1.2.4 细胞培养、瞬时转染分析EGFP在细胞中表达

小鼠成纤维细胞NIH-3T3和小鼠黑色素瘤细胞B16常规在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM/ RPMI-1640培养液中培养,在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育培养. 检测mTERT启动子在B16细胞和正常细胞NIH-3T3中的转录活性.首先,将上述两种细胞(1×105个/孔)接种到6孔板中,24 h后细胞至60%融合后用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂介导重组质粒pmTERTp- EGFP和对照质粒pEGFP-N1分别转染上述两种细胞.转染方法按照脂质体说明书操作.转染后继续培养48h后,用去卷积活细胞工作站Delta Vision观察报告基因EGFP的表达情况.

2.实验结果

2.1 mTERT启动子片段的PCR扩增

以小鼠肌肉细胞基因组DNA为模板, 以FW(mTERTp)01/RV(mTERTp)03为引物进行PCR扩增,获得mTERTp片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示,结果显示mTERTp片段大小约1100bp,与预期结果一致.然后将mTERTp片段连接到pEASY-T1载体上,得到重组质粒pEASY-T1-mTERTp.阳性克隆由华大基因生物技术有限公司进行测序验证,测序结果表明克隆的mTERT启动子基因序列与Genebank中mTERT启动子的序列一致.

讨论

端粒酶活性主要是由于TERT基因的转录受到严格的调控,TERT启动子一般只在肿瘤细胞中具有转录活性.所以用TERT基因启动子来调控抗肿瘤基因的表达,从而降低基因治疗中对正常组织的毒性,这已经成为肿瘤基因治疗的关键.本研究以小鼠基因组为模板PCR扩增得到小鼠TERT启动子(mTERTp)片段,将mTERTp片段和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)构建到载体pGL3-Enhancer上,得到重组质粒pmTERTp-EGFP.通过瞬时转染NIH-3T3和B16细胞,观察绿色荧光蛋白的表达.转染后48h观察到EGFP在B16细胞中大量表达,在NIH-3T3细胞中几乎不表达.说明我们构建的mTERT启动子元件可以特异性地调控目的基因在肿瘤细胞内表达.

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参考文献

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