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引物方面有关本科论文范文,与玉米种质资源RAPD分子标记优化体系的建立相关论文模板

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摘 要 :玉米是我国重要的作物之一,在我国农业生产中占有重要的地位.吉林省玉米生产条件优越,推广面积广,品种的多样性丰富,为实现品种的管理高效科学,本实验以用玉米为材料进行RAPD的研究.建立并优化了高效、稳定的玉米RAPD实验体系,为后续玉米品种的管理提供了理论基础和实验支持.

关 键 词 :玉米;RAPD;体系

中图分类号:S513 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2012)-10-0050-1

RAPD(random amplified polymorphic DNA,RAPD)也称之为AP-PCR(Arbitrary Primer PCR),即随机扩增多态性DNA技术,是由Williams和Welsh等发明的分子标记技术,是一项基于PCR技术的分子生物技术[1,2].是以基因组DNA为模板,常以一个10mer随机的寡核苷酸序列作引物,通过PCR扩增,产生许多不连续的DNA产物,以检测DNA序列的多态性.它可以在物种遗传背景没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行基因组指纹图谱进行研究,还可用于检测体细胞 和微生物分型[3].


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玉米是最为古老的栽培作物之一,目前为我国栽培作物的第二位.吉林省是我国的玉米大省,玉米种植面积在全国位于前五,每年审定的新品种数目为全国第一.由于目前玉米为品种检定手段还不完善,导致品种管理有一定的难度.故本文进行了玉米RAPD分子标记体系的相关研究.

1.材料与方法

1.1 供试材料

购买市售玉米主推品种种子.

1.2 试验试剂和仪器

TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer(含Mg2+)、10碱基随机引物、dNTPs;琼脂糖、DNA分子量标准(D2000Maker)等购自上海生工.

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1.3 RAPD方法

1.3.1 DNA的提取 以玉米种子产生的嫩芽为材料,使用植物基因组试剂盒提取.DNA回溶于灭菌水中,-20℃保存备用,1%琼脂糖凝胶电泳检测质量.

1.3.2 RAPD条件及扩增程序 根据王志刚[4]RAPD反应体系文献,玉米RAPD初始25μL反应体系包括:2.5μL 10×PCR Buffer、0.2μmol·L-1引物、0.5U Taq DNA聚合酶、0.1 mmol·L-1dNTPs、20ng模板DNA,用ddH2O补齐反应体系到25μL.

RAPD-PCR扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性50s,38℃退火40s,72℃延伸90s,35个循环,72℃后延伸10min

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1.3.3 RAPD反应体系优化 模板DNA浓度,TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTP定量对影响RAPD反应结果影响较大须进行优化.本试验将各种影响因素设置梯度,并进行正交实验,对各个相关参数进行了优化,以建立较为完善的反应体系和程序.


该文来源:http://www.svfree.net/moban/467857.html

1.3.4 RAPD产物检测 取5μl扩增产物,在1.5%琼脂糖凝胶上进行检测.凝胶成像分析系统照相保存数据并分析结果.

1.3.5 引物的筛选 将所选择的样品提取的DNA等量的混合,作为筛选引物的 DNA为模板.并对购买的100个随机引物分别进行相同条件的RAPD扩增,初步筛选出若干个多态性引物.再经过二次筛选,选取扩增DNA条带型清晰、差异性和多态性好的引物.最后确定出最佳的随机扩增引物.

2.结果

2.1 基因组DNA提取质量的检测

本试验使用试剂盒提取玉米基因组DNA,以1%的琼脂糖凝胶上检测,结果如图1所示.

图1 玉米基因组电泳检测结果

从图中可以看出,主带清晰,无拖带现象,间亮度均一,一般每克材料提取DNA产量在30~40g之间.说明提取基因组DNA质量好,产率高,完全满足RAPD反应体系的要求.

2.2 引物的筛选

通过实验从100个随机引物中,筛出22个扩增条带清晰,多态性好的引物.图2为部分实验结果.

图2 玉米RAPD部分实验结果

2.3 RAPD反应体系

通过实验对影响RAPD扩增结果的因子进行研究筛选,并对其影响因素进行了优化,筛选出了最合适玉米的RAPD条件,并利用该体系对所选的材料进行扩增,得到了清晰、多态性高的谱带,具有较好的重复性,说明该体系稳定可靠,适合于玉米的研究.

参考文献

[1] 李明芳,郑学勤.荔枝SSR标记的研究.遗传,2004,26(6):

911-916.

[2] 洪丹丹,王正加,黄坚钦.山核桃SSR反应体系优化.西南林学院学报,27,1:51-54.

[3] 代汉萍,雷家军,邓明琴.长白山野生草莓资源的调查与分类研究.园艺学报,2007,34(1):63-66.

[4] 王志刚,张志宏,李贺,等.利用RAPD和SCAR标记鉴定草莓品种.园艺学报,2007,34(3):591-596.

作者简介:李树国(1956-),男,吉林农业工程职业技术学院教授,研究方向:粮食学与生物化学.

参考文献:

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