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摘 要: 目的:建立一种简便、灵敏、特异的DNA检测方法.方法:用荧光偏振技术检测102例乙型肝炎患者血清中的HBV DNA,并与多聚酶链反应一酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)方法作比较.结果:该方法可以检测出1×101拷贝的HBV DNA模板,CV 为6.44%,对102例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA 阳性率为100%;HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为81.8%;HBsAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为72.4%,其余为阴性.30例非乙型肝炎患者血清中HBV DNA的检测结果均为阴性.结论:该方法简单、灵敏、特异,适用于临床进行大样本核酸检测.


探针自考论文怎么写
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关 键 词 : 乙型肝炎病毒 脱氧核糖核酸 多聚酶链反应 荧光偏振 检测

资料与方法

主要仪器和试剂:MJ Research V2.0;Victor Ⅱ荧光偏振检测仪;dNTPs、Taq DNA聚合酶.引物和探针:PCR引物源于HBV DNA C区:Ncbi Genbank:(AY123041.1 GI:22415734).C1(1901-1920):5'-TGGAGCTTCTGTGGAGTTAC-3';C2(2160-2141):5'-GGAGTGCGAATCCACACTCC-3';探针(1846-1832):5'-AAAGAAGTCAGAAGG-R110-3'.血清标本:102例已确诊的乙型肝炎患者血清,30例已确诊非乙型肝炎患者血清.

血清处理:煮沸法,具体操作步骤见文献[1].

PCR扩增反应和液相杂交[2]:取2μl模板加到28μ1 PCR反应液中(10×PCR缓冲液3μ1,dNTPs各160μmol/L,上游通用引物C1和下游通用引物C2各3pmol,探针1.5pmol,Taq DNA聚合酶1U).PCR程序:94℃ 2分钟后进入循环,94℃ 5秒,60℃ 55秒,72℃ 45秒,循环25次,最后94℃ 5秒,45℃ 20秒.

探针杂交[3]:取10μ1杂交后的PCR产物加入含有45μ1杂交液[其中含1g/L聚乙二醇4000,300ml/L DMSO,6×SSC(pH 10),0.01mol/L磷酸钠(pH 8.0),1mmol/I.EDTA(pH 8.0),5g/L SDS,100fg/ml变性鲑鱼精DNA,5g/L脱脂奶粉]的用于荧光偏振检测的微孔中,混匀后40℃水浴放置10分钟,然后用VictorⅡ荧光偏振检测仪检测荧光素R110的偏振值.

判定标准:随机选10份HBV DNA阴性血清和10份HBV DNA阳性血清进行检测,cut off值等于阴性样本结果的平均偏振光值+10%×阳性样本结果的平均偏振光值.偏振光值>cut off值×110%的样本为阳性,

结 果

PCR反应体系中探针浓度的确定

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:PCR反应液中探针浓度分别为50、5、0.5和0.05 μmol/L.分别对模板数为5×101拷贝的阳性对照和阴性对照进行PCR扩增和杂交,结果探针浓度为0.5~5μmol/L时均能检测阴阳性对照.当探针浓度偏低(0.05μmol/L)和偏高(50μmol/L)时,检测结果出现假阴性和假阳性,因此最终探针浓度确定为0.5μmol/L.

PCR-FP的最低检出量:对HBV DNA拷贝数分别为1×101、1×102、1×103和1×104拷贝及阴性对照进行检测,结果该方法可以检测到1×101 拷贝的模板.偏振光值分别为72、95、132、184和44mp(阴性).

重复性实验:用PCR-FP对一个HBV DNA阳性样本重复检测10次,偏振光值分别为115、110、97、117、96、105、98、109、108和113mp,CV等于6.44%.

PCR-FP与PCR-ELISA比较:用2种方法对102例乙型肝炎患者的血清进行检测,PCR-FP检测方法对HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出率为100%(40/40);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出率为81.8%(27/33);HBsAg(+)、抗HBc(+)血清检出率为72.4%(21/29).而30例非乙型肝炎患者的血清PCR-FP检验结果均为阴性.

讨 论

PCR-ELISA分3个主要步骤,第1个步骤是PCR扩增,第2个是PCR产物和探针的杂交过程,第3个是ELISA检测.而PCR-FP方法将上述第1和第2步合二为一,因此PCR扩增和探针液相杂交在同一管中进行,即将探针直接加到PCR反应液中,随PCR反应一同完成.由于探针的3'端为ddUTP-R110,使得探针不能被延伸;另外探针的退火温度为40℃,而PCR引物的退火温度为60℃.因此,在PCR过程中,荧光标记探针无法与模板结合,不会影响PCR反应.PCR反应结束,荧光标记探针则与PCR产物上相应区域结合,形成杂交双链.在反应体系中加入杂交液可使产物双链DNA的退火温度降低至40℃下,可使非特异的杂交探针解离,提高了探针与产物杂交的特异性.由于荧光素和双链DNA相连,相对分子质量明显增大,从而使荧光偏振增大,而游离探针上荧光素的荧光偏振光不增加,由此仪器可以将特异杂交双链检测出来.

我们的方法目前需要解决的问题:PCR扩增用的微孔板与荧光偏振光检测用的微孔板尚不能通用,PCR扩增产物必须手工转移到荧光偏振光检测用微孔板中,因此操作仍存在麻烦之处,也存在污染的可能,需要采取防污染的措施.但是,我们的方法与PCR-ELISA相比,实现了扩增与杂交一体化,简化了操作步骤,缩短了整个实验的时间.

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参考文献

1 Guo YH,Yan J,Meng XR,et al.A quantitive PCR kit used in automatic geic amplification instrument.J Fourth Mil Med Univ,2001,22:1349-1351.

2 Dieffenbach CW,Dveksler GS.PCR primer a laboratory manual.USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995:143-153.


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