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摘 要 :根据羊特异性线粒体DN 段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定.PCR扩增产物DN 段大小为295 bp.用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp.PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA.合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的DN 段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果.利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%.结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定.

关 键 词 :羊源性成分;PCR;检测;灵敏度;特异性

中图分类号:S826.9+2 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)19-4694-04

DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2014.19.049

Establishment and Application of Detecting Sheep

Ingredient in Meat Products PCR

XIONG Rui, GUO Feng-liu, LIU Xiao-hui, ZHAO Tong-xin, WANG Na, YAN Hong

(Baoding Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Baoding 071051, Hebei, China)

Abstract: A PCR method for detecting the sheep

关于肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立其应用的本科论文范文
羊肉有关论文范文集
ingredient in meat products based on the sheep specific mitochondrial DNA fragment was established. A pair of special primer was designed to amplified 295 bp fragment of sheep. A Sau3AⅠdigestion was simultaneously made to verify the specificity of the PCR amplification. The results showed that a specific amplification fragment of the expected size was obtained and confirmed that it was positive for sheep meat, but negative for horse, canis, donkey, rabbit and pig meat etc. The detection limit was 0.225 pg DNA. The 83 meat products of sheep were detected using PCR method, with the positive rate of 100%. It is indicated that the method is quick, convenient, sensitive and specific, and can be used for identifying of ovine ponents from sheep products.

Key words: sheep ingerdient; PCR; detection; sensitivity; specificity

羊肉包括绵羊肉和山羊肉,因其具有天然的滋补功效,长期以来都受到广大消费者的青睐.随着市场流通的日益发达,羊肉经过冷冻、加工后再 已成为现代市场营销的主要手段,但是羊肉一般经过冷冻,特别是经过加工后的熟羊肉通过感官检查已很难区分真伪,因而一些不法商贩在高额利润的驱使下,在肉制品的生产与销售中利用鸭肉或猪肉以假充真、以次充好[1],这引起了广大消费者的强烈愤慨.这不仅仅涉及到了经济、营养等问题,更直接影响着消费者的健康,尤其是对某些食物过敏的消费者[2、3].此外,还会涉及到宗教信仰的问题,如在清真食品中掺杂进猪肉等[4].

目前,采用免疫学方法可以对不同的生鲜肉进行鉴定[5],但是对于热加工处理的肉类制品,由于其中的蛋白质成分或免疫原性物质遭破坏而无法对其来源进行准确鉴定.因此,建立一种对肉类制品准确、特异和灵敏度高的鉴别方法,对食品监管部门而言已迫在眉睫.随着研究技术的发展,食品中肉类成分的鉴别与分析已逐步形成了分别以蛋白质和核酸检测为基础的方法体系,其鉴别精度可达属或亚属水平,检测灵敏度也达到了纳克级[6],以PCR技术为基础的种属检测技术最为突出.因此,本研究根据羊特异性线粒体DN 段,设计合成一对引物,利用引物建立一种运用PCR技术鉴定真假羊肉的方法,并对大量市售羊肉制品进行羊源性成分检测,为保护广大消费者的利益和进一步落实食品质量安全市场准入制度提供了技术保障,也更好地为食品监管部门提供强有力的技术支持.


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1.材料与方法

1.1 材料

试验用羊、马、狗、驴和兔等15种动物生鲜肉均为市售.熟羊肉、高压羊肉(121 ℃,高压30 min)均为河北检验检疫技术中心保定分中心加工.

1.2 仪器与试剂

1-15PK型台式离心机(德国Sigma公司);Veriti型梯度PCR仪(美国ABI公司);HT4型凝胶成像系统(法国VILBER LOURMAT公司);PS300-B型电泳仪(美国Hoefer公司).

试剂:10×PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、Sau3AⅠ限制性内切酶、DNA Marker 2000、蛋白酶K、RNA酶、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒和凝胶回收纯化试剂盒等均购自北京天根生化科技有限公司;PCR扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成;其余试剂均为分析纯. 1.3 试验方法

1.3.1 引物设计与合成 根据GenBank中羊源性特异性DNA引物序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性羊源引物.引物用高压灭菌后的去离子水溶解并配制成100 mol/L的储备液.引物序列:上游引物序列为5’-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3’;下游引物序列为5’-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3’.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

1.3.2 样品DNA的提取 取绞碎的羊、马、狗、驴、兔等15种动物生鲜肉及熟羊肉和高压羊肉,按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取模板DNA.取适量模板DNA,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260和280 nm处的吸光值A260和A280.A260/A280比值为1.7~1.9,适宜于PCR扩增.

1.3.3 PCR扩增 PCR反应体系为50 μL,各成分含量为:10×PCR反应缓冲液5 μL,25 mmol/L MgCl2 溶液3.0 μL,2.5 mmol/L 4×dNTPs 4.0 μL,引物sheepF和sheepR(25 μmol/L)各1.0 μL,DNA 模板1.0 μL,Taq DNA聚合酶1 U,无菌去离子水31.0 μL,混匀后离心,在PCR仪上开始循环.循环参数为:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性60 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,30个循环.72 ℃延伸5 min.最后4 ℃保存备用.

1.3.4 PCR产物鉴定 ①电泳鉴定.取扩增产物8 μL,在2.0%琼脂糖凝胶中电泳,采用TAE电泳缓冲系统,9 V/cm恒压电泳,DNA Marker 2000作为对照.电泳后Goldview染色,于凝胶成像仪下观察电泳结果.②Sau3AⅠ酶切鉴定.取PCR产物电泳,回收其中的DN 段,进行Sau3AⅠ酶切,于2.5%琼脂糖凝胶中电泳鉴定.

1.3.5 PCR扩增产物测序 将PCR扩增的产物经凝胶回收纯化,交由上海生工生物工程有限公司进行测序.序列校对后,在GenBank中进行BLAST比对分析验证所得片段是否为所需要片段.

1.3.6 特异性试验 取已制备的羊、马、狗、驴、兔等15种动物肉的DNA各0.1μg作为模板,加入体系中进行扩增,同时设立阴、阳性对照,电泳鉴定.

1.3.7 灵敏性试验 将制备的生羊肉、熟羊肉和高压羊肉的DNA模板依次做10倍递增稀释,直到1×10-12,每个稀释浓度各取2 μL作为模板,进行PCR扩增,同时设立阴、阳性对照,电泳鉴定.

1.3.8 市售肉制品的羊源性成分检测 购置市售生羊肉40份、熟羊肉43份,提取其总DNA,用建立的PCR方法检测其羊源性成分.

2.结果与分析

2.1 PCR方法的建立

以生鲜羊肉、熟羊肉和高压羊肉所提取的DNA为模板进行PCR扩增,均能得到295 bp的目的DNA条带,与预期片段大小一致(图1).

2.2 PCR产物的酶切鉴定结果

取PCR产物电泳,回收其中的DN 段,进行Sau3AⅠ酶切,获得的204 bp和91 bp片段,与预期片段大小一致(图2).

2.3 PCR扩增产物测序结果

将所得片段回收、克隆、测序、校对后,在NCBI中经 BLAST比对分析, 结果表明,羊源性成分DN 段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Ovis aries的基因序列的相似性均大于99%,证明所得片段均为目的片段(图3).

2.4 特异性试验结果

以建立的肉制品中羊源性成分的PCR检测方法分别对羊、马、狗、驴、兔等15种动物肉的DNA进行扩增,结果发现,运用该引物对马、狗、驴、兔等14种动物肉的DNA扩增均呈阴性(图4).

2.5 敏感性试验结果

将制备的生鲜羊肉、熟羊肉和高压羊肉的DNA模板不同稀释度为模板的扩增结果表明,当反应体系中含羊源性成分全基因组DNA 0.225 pg时,经过30个循环的扩增,电泳后可在紫外灯下见到明显的扩增目的条带(图5).

2.6 市售肉制品的羊源性成分检测结果

使用本研究建立的PCR方法对市售的83份羊肉制品中羊源性成分进行检测,结果发现,羊源性阳性数量为83份,阳性检出率为100%.

3.小结与讨论

有相关研究表明,肉在热加工过程中,DNA会发生降解,其长度在120 ℃时会锐减至600 bp以下[7],因此,选择了扩增长度为295 bp短片段,以避免出现假阴性结果.试验结果表明,利用羊源性引物扩增出的产物,经电泳与Marker相比较,并经Sau3AⅠ内切酶酶切鉴定和序列比对后,确实与预期的DN 段大小一致,用该引物可以进行生熟羊肉基因组DNA的扩增,且扩增产物一致,而其他14种动物肉DNA则无任何扩增效果.在试验中,确定PCR鉴定羊肉的灵敏度达0.225 pg DNA,其敏感度较核酸探针杂交鉴定肉种类高5×104倍.运用本方法对市售的83份生熟羊肉制品进行鉴定,检测准确率达100%,同时还对这83份样品做了鸭和猪源性成分的检测,发现有掺假现象,原因是一些不法企业和个人使用廉价的鸭肉或猪肉代替价格较高的羊肉进行销售,从中牟取高额利润,同时鸭肉的纹理与羊肉更为相似,使得相应的掺假更具有隐蔽性,可以逃脱相关部门的监管.

PCR方法以其快速、灵敏、操作简单、节省费用等特点逐渐成为质检部门检测的主要手段,与其他动物DNA没有交叉反应,特异性强[8].使用本试验中的引物对肉制品进行定性分析足以满足市场检测的要求,同时该法也为将来对肉制品中各源性成分含量定量检测奠定基础[9].肉制品中羊源性成分PCR检测方法着重解决了肉类,尤其是熟肉、熟肉制品的种类鉴定问题,克服了传统方法由于蛋白质变性而失能的困难,使肉种类鉴定达到一个新的阶段,可为更好地保护人们的利益和进一步落实食品质量安全市场准入制度提供技术保障[10].

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参考文献:

[1] 王丽媛.PCR技术在肉类品种鉴别中的应用研究[D].北京:中国农业大学.2006.


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