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【摘 要 】自然界仅有RNA病毒以RNA作为基因载体.依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)在这种病毒的增殖复制期起到了非常重要的作用,它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因,另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA,所以它担负了复制酶和转录酶双重功能.由于酶的结构复杂,稳定性差,在分子水平对它进行分析存在许多困难.人类和动物的许多严重疾病是由RNA病毒引起的,如人的SARS、流感、甲肝、丙肝、艾滋病、麻疹、出血热、脑炎、脊灰、某些肿瘤;动物的口蹄疫、猪瘟、鸡瘟等等.RNA病毒不仅严重威胁人类健康,也给工农业生产带来巨大损失,因此加强RNA病毒研究不仅是开启生命起源神秘大门的钥匙,也是保护人类健康,促进农业生产和生物多样性研究与保护的重要途径.本文仅就RNA病毒的RNA聚合酶以及反向遗传学这两个方面的研究进展做一简单介绍.

【关 键 词 】RNA病毒;RNA聚合酶

【中图分类号】R373【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)12-0025-03

地球上的原始生命形态是从RNA开始的.在RNA作为生命起源的进化历程中,RNA病毒起了不可替代的作用.自然界中RNA病毒的种类和数量都堪称病毒之冠,其基因组转录复制的多样性也可谓病毒之首.所有的RNA病毒在病毒基因组的复制过程中都编码一个依赖RNA的RNA聚合酶.此酶与宿主的蛋白质(有时还需病毒的蛋白质)一起发挥催化功能[2,3].在其序列保守性方面,绝大多数RNA聚合酶蛋白已经被阐明;然而关于这类酶的催化活性,到目前为止只有少数几种已从生化的角度得到研究阐述,这包括:Qβ复制酶亚单位II[4],脊髓灰质炎病毒的3D Pol蛋白[5~7],丙型肝炎病毒NS5B蛋白[8~10]和烟草脉斑驳病毒(TVMV)的核内包涵体蛋白NIB[11].

Kamer和Argos于1984年阐明了几种序列基元,它们在某些动物和植物的正链RNA病毒的RDRPs和脊髓灰质炎病毒的3D聚合酶中广泛存在.以后的研究在此基础之上又扩展至更广范围的病毒和更多的基序.到如今已经发现8个保守的RDRP基序[12,13].现已知这8个保守基序中的4个存在于所有聚合酶的“掌部”结构域中的催化活性部位[14,15].当前,对于脊髓灰质炎病毒的3D Pol蛋白的研究日趋深入[14].这项工作的目的是以脊髓灰质炎病毒的聚合酶的晶体结构做指导,利用计算机预测多种RDRPS的二级结构并对结构与功能的关系进行分析.目前面临的问题有:其它病毒的RDRPS也具有与脊髓灰质炎病毒的聚合酶相同的结构吗?它们也具有脊髓灰质炎病毒的聚合酶所具有的独特区域吗?它们在一致序列的相似区域中也存在可以识别的掌部基序吗

RDRP的结构和功能的分析不可能完全游离于其他三种聚合酶之外,所以在此简要介绍一下依赖DNA的DNA聚合酶(DDDPs)、依赖DNA的RNA聚合酶(DDRPs)和逆转录酶(RT)的晶体学研究.第一个结构研究清楚的是Escherichia Coli的DNA聚合酶I的Klenow片段(KF),这是一个DDDP[15].此酶的整体形状好象一只带有手指、手掌和大拇指亚结构域的“右手”(图A).在1992年报道了HIV-I RT的结构[16].两种聚合酶的结构比较发现,尽管在这两种蛋白之间缺乏序列上的一致性,它们都具有“右手”形状的 结构.这揭示相对于一级序列,酶的 结构似乎更具保守性.KF和HIV RT的“手掌”亚结构域可以互相重叠,被认为是同源的[17].两种酶的“大拇指”结构域大多数是α-螺旋,但是它们的二级结构的排列并不相同.HIV RT的“手指”亚结构域大部分由B-折叠组成,而KF的“手指”亚结构域大部分由α-螺旋组成[17].而且, KF,T7 RPO和HIV RT中编码“手指”和“大拇指”亚结构域的基因序列的线性排列也互不相同(图2).


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Sousa等人于1993年描述了T7 RNA聚合酶(T7 RPO)的晶体结构.此酶的“手指”、“手掌”和“大拇指”亚结构域均与KF极为相似.这提示KF和T7 RPO中主要由α-螺旋构成的“手指”亚结构域是依赖DNA的聚合酶的一个特点;而HIV RT中主要由β-折叠构成的“手指”是那些既能以RNA又能以DNA为模板的聚合酶的一个特点[16, 18].

接下来的关于聚合酶与DNA引物-模板共聚体的研究更增加了我们对于聚合酶的结构与功能的理解.迄今为止已经获得了HIV RT的聚合酶共聚体的结构[19],许多DDDPs,包括E.Coli(KF,[20]),B.Stearo Thermo PhiluS[21]和T.A Quaticus(TAQ,22)的同种的Pol I的共聚体结构,以及T7 DNA聚合酶的共聚体结构[23].这些研究使我们逐渐明了了聚合酶-模板之间发生的相互作用和催化反应.引物-模板与“手指”、“手掌”和“大拇指”亚结构域通过直接的由水介导的主链的内部作用而定位,这使得酶与DNA能以一种序列各自独立的方式结合.蛋白和碱基间的唯一接触是在活性位点附近,其作用是保证合成的忠实性.DNA模板-引物以A-构象和B-构象结合成杂合体(图A).尽管活性位点上游4-5个碱基对处的双螺旋是B-构象,在接近活性位点处的碱基对却因具有宽而平的小沟而使人联想起A-构象的DNA双螺旋.这样,一个嘌呤的N3位和一个嘧啶的O2位可以特定的氢键而形成新的碱基对.这两个基团在G:C碱基对和A:T碱基对中表现一致[24]而且可以和通常的Watson-Crick形式的碱基对相互识别.

这些研究也说明核苷酸结合位点是由“手指”、“手掌”亚结构域的氨基酸、模板的碱基以及临近的碱基对经复杂的内部作用而构成的.这个“口袋”有助于选择正确配对的核苷酸,因为如果是错配,核苷酸就不能以合适的几何构型进行结合.最初,我们猜想模板DNA穿过酶的“手指”和“手掌”亚结构域间的狭缝[15,16],然而,晶体结构显示事实并非如此.在晶体结构中,引物链的3’末端位于保守的天冬氨酸附近,这些天冬氨酸在催化活性中心起关键作用;而模板链的5’末端在酶的“手指”和“手掌”亚结构域的影响下急拐了一个90度的弯(图1).酶的“手指”和“大拇指”亚结构域的位置因是否结合了模板链而有所不同.当没有结合模板链时,聚合酶处于一种开放的状态.然而,当模板结合上来以后,酶的“手指”和“大拇指”亚结构域就合拢,形成一个“钳子”钳住DNA链.“大拇指”的指尖在小沟中活性位点上游4-5bp处经水介导直接或间接地与磷酸二酯主链发生相互作用[23].在有模板结合时,“钳子”的“大拇指”部分被认为是固定不动的;而“手指”亚结构域的一部分可以随着每一个碱基对的形成而打开和关闭[22,23].

催化反应包括据信在所有的聚合酶中都会发生的保守的羧化作用[17,25].这种“二金属离子”机制最初是在类似的DNA聚合酶I的3’-5’核酸外切活性机制的基础上提出的[17,26].在此机制之中,两个金属离子通过两个羧基、水、生长链的3’-OH和三磷酸腺苷中非酯化的氧原子联系在一起(图3).金属A激活α磷酸的3’-OH的亲核攻击,而金属B稳定焦磷酸防止其脱离集团.

病毒RNA聚合酶的氨基酸序列比较研究证实保守区域有下面三种功能:包括RNA聚合、三磷酸核苷酸 (NTP)结合、模板和产物结合的RNA聚合酶功能;对分子内二级结构或模板 -产物双倍体的RNA进行解链的螺旋酶功能;RNA戴帽的甲基转移酶功能.典型的GDD三肽现在被认为是RNA聚合酶的明显标记,许多情况下,GDD由酪氨酸领头定位在疏水氨基酸的延伸处.(Y)GDD周围的序列在复制阶段相同的每组病毒中具有同源性.复制过程中来源于不同正链和负链病毒的RNA聚合酶,即使在最保守的GDD区也有差异.分段负链病毒的保守序列是SDD,而非分段的负链病毒的则是GDN(Q).双股病毒的保守序列更接近于正链病毒,被修改成(Y)MDD[27].

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Poch等认为RNA聚合酶由四个主要的区域组成:A区D*****D为酸性区,B区G***T***(N/E)(S/T)是核苷酸结合的核心区,C区(Y)GDD是催化功能核心区,D区LKR为碱性区.这些区域经常被易变的

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绞链 (hinges)结构有规则地分隔并联成一个连锁区域[28].人免疫缺损病毒(HIV)Ⅰ型反转录酶的结构中,保守的(Y)GDD区存在于酶活性中心的β发夹中[29].Inokuchi等假定这个区参与了金属离子结合于酶催化位置的过程,这在θβ和脊髓灰质炎病毒的RNA聚合酶中得到了证实.这个区域突变能导致酶活性丧失.某些病毒RNA聚合酶该区域的一两个位置上含有不同的氨基酸残基,如:(Y)GDD的酪氨酸在细小核糖核酸病毒的RNA聚合酶中是严格保守的,但在黄病毒中则是易变的.用蛋氨酸取代脊髓灰质炎病毒的(Y)GDD区的酪氨酸则导致功能丧失的突变,这种突变也能被分子内二次突变所抑制.半胱氨酸在TMV、蛋氨酸在南方菜豆花叶病毒(SBMV),丝氨酸在黄热病毒(YFV)、BMV和AMV的保守区中发现,这个区域氨基酸的改变,可能被其它地方同样分子的二次突变所抑制.有两个非常保守的区域和嘌呤三核苷酸的结合活性相关,A区(G/A****GKS/T)和位于A区下游约20~40个氨基酸处的B区(DEAD).B区与依赖RNA或DNA的NTP酶活性关联的MG NTP复合体中的MG离子相互作用.两种DNA螺旋酶参与了复制、重组和DNA修复.

有人将脊髓灰质炎病毒3D聚合酶的晶体结构与其他的聚合酶做比较并得出一些结论.首先,脊髓灰质炎病毒聚合酶的总体结构也好象一只右手,这与DDRPS、RTS和DDDPS相一致.其“手掌”亚结构域与其他三种聚合酶中观察到的“手掌”极为相似.这个“手掌”结构域里含有在所有种类的聚合酶中都存在的四氨基酸序列基序:A、B、C和D,除此之外,还有第五个基序E,基序E是RDRPS和RTS所特有的.“大拇指”结构域主要由α-螺旋组成,不过,它和DDRPS、HIV RT或者T7 RPO的“大拇指”的结构并不相似.“手指”亚结构域的大部分在这些晶体中都是不规律的,而其指关节以下的可见部分在结构上与其他种类的聚合酶也不相同.其次,脊髓灰质炎病毒的晶体结构也支持“二金属离子”的催化机制:保守的天冬氨酸为进行催化反应处于合适的位置上.

除了“手指”、“手掌”和“大拇指”亚结构域以外,脊髓灰质炎病毒聚合酶还包括一个独特的手指N-末端区,这在其他种类&

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